qpcr忘了加rox会有什么影响的简单介绍

摘要： 本篇目录：1、PCR时引物加多了2、pcr扩增用的试剂有哪些?...

本篇目录：

• 1、PCR时引物加多了
• 2、pcr扩增用的试剂有哪些?
• 3、如何作QPCR的标准曲线
• 4、如何通过qpcr看一个基因的表达丰度
• 5、qpcr怎么转换成热点图
• 6、如果一个基因没有表达,realtimeqpcr会测出来吗

PCR时引物加多了

内标加多了对实验结果有影响，因为量加多了有饱和度的。

只要过量不是很离谱，一般都能扩增出来，只不过引物过多通常会降低扩增的特异性。

在引物设计时，需要对引物进行Blast，确保其特异性。扩增效率：引物一般反应浓度在0.2 μmol/L。建议把引物稀释成10 uM，20 μl的PCR体系一般加0.5-0 μl的引物，引物过少影响扩增效率，过多会产生引物二聚体。

适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成6μg的DNA（dNTP消耗一半），所以，你不小心多加了4倍的量，会很影响PCR结果，即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

dutp加多了会对pcr造成酶失活。dutp加多会引物质量，引物的浓度，两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想，容易弥散的常见原因。

信号饱和，偏差扩大。信号饱和：起始量过多导致PCR反应过于强烈，信号会饱和，使得结果无法准确测量。偏差扩大：过多的起始量会增加PCR扩增的循环数，导致结果的扩增效率偏高，从而引入扩增偏差和误差。

pcr扩增用的试剂有哪些?

1、一些共溶剂和添加剂能够降低错误率，提高扩增效率。共溶剂有甲酰胺（25-10%，v/v）、二甲基亚砜（最高可到15%，v/v）及甘油（1%-10%，v/v）。添加剂包括氯化四甲铵、谷氨酸钾、硫酸铵。

2、甲酰胺是一种常用的有机PCR添加剂。它可以和DNA中的大沟（major groove）和小沟（minor groove）相结合，从而降低母版DNA双螺旋的稳定性并且减低DNA的解链温度（melting temperature）。

3、需要购买的 做pcr扩增用的试剂： PCRmix，或者酶，dntp等，电泳的试剂：胶，buffer，核酸染料，marker。如果做荧光定量或者测序，需要荧光修饰的引物，还得合成。耗材：pcr板，吸头，pcr管。还有很多别的东西。

如何作QPCR的标准曲线

1、作QPCR的标准曲线可以用PCR－ELISA法作。具体如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合；再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。

2、先来了解一下什么是Ct值？阈值循环数Thresholdcycle(Ct)也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline）。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。

3、然而，在进行qPCR实验时，需要注意样品处理的准确性、引物和探针的设计和优化，以及标准曲线的建立和数据分析等步骤，以确保可靠和准确的结果。

4、qpcr ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。

5、Real-time qPCR定量方法 可以分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。

6、以此标准品绘制logN与Ct的标准曲线，然后根据靶标基因的Ct值即可反推出靶标基因的精确个数。

如何通过qpcr看一个基因的表达丰度

1、计算每个样本的 ΔΔCt 值，即用待比较样本的 ΔCt 值减去一个对比样本的 ΔCt 值，得到 ΔΔCt。计算每个样本的目标基因表达量的相对水平，即将 ΔΔCt 值代入公式 2^-ΔΔCt 中。

2、先来了解一下什么是Ct值？阈值循环数Thresholdcycle(Ct)也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline）。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。

3、如何采用QPCR检测超低表达的目的基因 如果避免了预扩增，数据可转换成绝对的cDNA数量，否则数据分析可以Cq值来开展，因为每个细胞的转录本水平呈对数正态分布。

4、mRNA一般使用RT-qPCR进行“定量”PCR。步骤前三步同于“半定量”PCR，第四步PCR的时候，用的PCR试剂，必须带有荧光素，用实时定量PCR仪检测。通过数据分析，得到mRNA的含量。

5、扩增过程：使用qPCR仪对PCR反应进行数轮扩增，扩增曲线中根据扩增产物的拷贝数与相关基因的相对丰度呈正比关系，多次扩增后产生的曲线在最后一个扩增周期称为CT值。

6、首先考虑是你的电压可能有点高，降低电压后适当延长时间可以改善。胶灌的如何，MARKER好象有点变形 加样问题 建议用本次的样品重新跑个看看，排除一下电泳体系的问题。

qpcr怎么转换成热点图

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

第五步：将X-title删掉，Y-title改成QPCR的Relative Expression，把Data-1改成你设计的引物，比如occludin。第 六步：结束第五步后开始进行统计学分析。点击左上方Analysis下面的Analyze。会弹出Analyze Data的对话框。

如果避免了预扩增，数据可转换成绝对的cDNA数量，否则数据分析可以Cq值来开展，因为每个细胞的转录本水平呈对数正态分布。一开始，可以各种方法对数据作图，此外，基本的统计分析也应开展（如阳性细胞的数量、平均值和偏差）。

MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

如果一个基因没有表达,realtimeqpcr会测出来吗

如果一个基因没有表达，realtimeqpcr会测出来 一般来讲，进行real-timeqPCRMasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。

Real-time qPCR定量方法 可以分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。

real-time PCR：实时PCR(real-time PCR)属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

不是用来测浓度的，可以用来做基因的拷贝数。测浓度最经典的还是紫外分光光度计，当然会有偏差，不过总体来说还是可以的。也可以用酶标仪。

选好内参基因，特别是同一物种不同组织中某基因的表达情况，一定要别人报道过在你检测的组织中变化不大，如果你只是拿一个别的物种中的同源基因，别人肯定会argue你的，如果有可能可以双内参。

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